1：目的的蛋白是否存在于某样品

2：表达情况，上调还是下调？比如正常和疾病组织之间的差异

对于悬浮细胞：离心收集细胞，轻轻vortex或者弹击管底以把细胞尽量分散开。按比例加入裂解液。轻弹管底以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。

组织：组织称重，玻璃匀浆器匀浆，或使用手持式组织研磨仪研磨，或使用超声破碎仪，直至充分裂解。也可以把组织样品冷冻后液氮研磨，研磨充分后加入裂解液进行裂解。按比例加入裂解液，超声破碎，离心4 °C，12000g，20min，取上清。

1：会涉及到提取核蛋白和膜蛋白

2：裂解液的选择

步骤：

1：配置分离胶，灌分离胶，

 

加水隔绝空气，等待凝固后，在水和分离胶中间会出现分界线，然后倒掉水。

2：配置浓缩胶，灌浓缩胶

3：上样

上样的总蛋白在20-50ug，尽量保证上样量以及体积一致。

4：电泳  电泳条件根据目的蛋白进行适度调整

一般恒压80-120V

制备凝胶中的要点

• AP要新鲜配制；

• 混合搅拌速度太快易产生气泡影响聚合， 导致电泳带畸形，太慢不均匀；

• 分离胶勿倒的过满，需留一定的空间；

• 凝胶需缓慢凝固，TEMED、AP用量过多会导致胶太硬， 从而电泳时易烧胶

• 保持所有装置清洁；

• 试剂要有正确的pH值，及妥当的保存

转膜后确认：

丽春红染色，属于可逆染色，检测转膜效率，与下游的WB检测无影响。

转膜的注意事项

封闭前

封闭后

备注：

为了获得最佳的实验效果，需要参考抗体的说明进行预实验，以达到最好的检测效果。

快速（一种抗体）

没有二抗交叉反应引起的非特异性条带，无信号二级放大免疫反应性降低

间接法：

额外的二抗孵育以及条件优化 ，信号放大灵敏度高（多个二抗 结合位点）

阳性对照：检测一抗是否有表达

阴性对照：检测一抗特异性

空白对照：不加一抗，只加二抗，检测二抗是否有交叉反应